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抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中,也分布于组织液及外分泌液中。
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细胞检测

  SOD的检测方法:

  1.分光光度法

  分光光度法是最为典型的检测SOD的方法,这种方法使用了细胞色素 C(cytochrome C)或者氮蓝四唑(NBT)(图1)。用cytochrome C的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochrome C会生成紫色的染料(图解 2)。这是自SOD被发现以来最常用的方法   Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2

  因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原,因此必须要考虑样品的污染因素。而且,这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下,因此不适合做大批量的实验。NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(max: 560 nm)去和O2-反应。这种染料不溶于水,在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物,从而影响实验数据的重现性。为了得到水溶性的甲臢染料,许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。但是,添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂,而且NBT会被多种还原剂所还原。NBT的这种特性被用于酮胺的检测,酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率,原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应。

  2.化学发光法

  用于O2-检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测,这种探针分为2种,一种是光泽精,另一种是荧光素衍生物(MCLA)。这种化学发光反应对pH有高度的依赖性。例如,光泽精只有在pH 9.0或者更高处会发出强烈的化学光。因此,在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的。另一方面,MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光,因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测。但是,MCLA不适合用作SOD检测的探针,因为它不单单和O2-反应,还会和单质氧反应。而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光,转移的金属离子还会加速氧化反应。

  3.电子自旋共振(ESR)光谱法

  在室温下,溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出,但能够通过自旋捕捉法间接获得。最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O2- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图,因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种。然而,DMPO与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低,因此需要向溶液中加入大量的DMPO(如:终浓度为0.45M)。这样,每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。 这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备。

  4.利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法

  为了克服上述的诸多问题,我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面:实验设备要简单、经济,pH灵敏度要低,对O2-有高度的特异性。如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话,就需要一种与cytochrome C和NBT相似的比色探针。检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下,测定出SOD100%的抑制率。为了得到一种新的检测SOD的方法,我们对还原后能生成水溶性甲臢的四唑盐作了一系列的实验。

病毒检测

  (RV CMV TOX)IgG病原体检测步骤:

  1仔细核对标本姓名、性别以及检测标本数目。2将试剂盒从冰箱中取出,恢复至室温。

  3根据检测标本的数目,确定反应板孔的数目。每项反应板必须设置对应的阴性对照孔、阳性对照孔、空白对照孔。

  4每孔加样10UL,然后滴加标本稀释液2滴,轻微震荡混匀,然后封板温育30分钟。

  5配置洗涤液:使用前用浓缩洗涤液和蒸馏水按照1:20的比例稀释。

  6温育完成后,用配置好的洗涤液洗板5次,拍干。7每孔加酶标液2滴,轻微震荡混匀,然后封板温育30分钟。8温育完成后,用配置好的洗涤液洗板5次,拍干。

  9每孔先后加显色剂A和B各一滴,轻微震荡混匀,封板温育10分钟。

  10肉眼观看结果。蓝色为阳性,浅蓝色为弱阳性,无色为阴性。

  (CMVTOX)IgM病原体检测步骤:

  1仔细核对标本姓名、性别以及检测标本数目。

  2将试剂盒从冰箱中取出,恢复至室温。

  3根据检测标本的数目,确定反应板孔的数目。每项反应板必须设置对应的阴性对照孔、阳性对照孔、空白对照孔。

  4每孔加样50UL,轻微震荡混匀,然后封板温育30分钟。

  5配置洗涤液:使用前用浓缩洗涤液和蒸馏水按照1:20的比例稀释。

  6温育完成后,用配置好的洗涤液洗板5次,拍干。

  7每孔加酶标液1滴,轻微震荡混匀,然后封板温育30分钟。

  8温育完成后,用配置好的洗涤液洗板5次,拍干。

  9每孔先后加显色剂A和B各一滴,轻微震荡混匀,封板温育10分钟。

  10肉眼观看结果。蓝色为阳性,浅蓝色为弱阳性,无色为阴性。

抗体检测

  抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中,也分布于组织液及外分泌液中。

  血凝和血凝抑制试验

  一、血凝原理:

  正粘病毒(流感)和副粘病毒(新城疫)病毒等有血凝素,能够使家禽的红细胞凝集。

  二、抗体监测原理:

  血凝抑制(HI)试验。抗体监测。利用抗体来中和病毒使血凝能力不断下降。

  三、凝和不凝的判断。病毒与家禽的(有核)红细胞结合后产生凝集,红细胞带上电荷相互排斥而在一定时间内(大于半小时)不沉淀。一般的细胞则在重力的作用下沉淀下去,是为不凝集。(最后都沉)

  四、血凝的判断:以完全不沉为凝集。半沉半凝集不算。(即沉的是不凝,不沉的是凝)

  五、血凝试验的作用:1、判断有无病毒。2、疫苗的凝集价。

  六、对血细胞要求:SPF鸡血最好,健康未免疫鸡次之,免疫健康鸡最差(大量用),病鸡坚决不用。大量使用的免疫健康鸡血应多洗几遍。

  七、采血洗血步骤:

  1、取无菌10ml注射器加入5%枸橼酸钠(防凝血)。

  2、垂直或水平采血。

  3、将血放入离心管,放入离心机中,加另一全是水的起平衡作用的离心管,使离心机从0逐渐加到1500~2000转,10 ~15分钟,停机,取出离心管,用吸管吸取上清液及一层薄薄的白细胞再加生理盐水,再离心,多次离心,(将细胞可能因免疫所致的影响降低)。最后将红细胞配成0.5 ~1%备用。

  八、血凝试验:

  在96(8×12)孔微量板上以1~2排(8~2×8个)为单位,用微量移液器每孔加50微升生理盐水,在每组的第一孔加50微升待测液体,然后向后倍比稀释,弃去最后一滴于盛废液的容器中。再每孔中加入配好的红细胞悬液50微升,在振荡器上作用2分钟。置室温下,大约30-40分钟时看一下结果。注意设对照。

  以彻底不沉为凝集,数数即可。利用此结果进行稀释标准抗原至4个病毒单位(注意体积换算)以备抗体监测之用。抗体监测与血凝试验刚好是反着的。

  九、血凝抑制试验:

  1、采血制血清:

  2、抗体监测步骤:

  ⑴、在96孔板上每孔加入50微升生理盐水

  ⑵、在第一孔加入待测血清或卵黄液,倍比稀释弃去最后一滴

  ⑶、加入4单位的标准抗原或相近品

  ⑷、各加入50微升配好的红细胞悬液

  ⑸、振荡2分钟置室温下作用30-40分钟。

  从左始,以完全沉淀为准计数,即2的几次方。同时要做对照。

  3、血凝抑制试验结果判断:以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的HI滴度。2 的4次方以下,抗体水平低,2的5次方到2的十次方可以.小鸡可5或6,但大鸡不行,就是该做苗了。如果数相差大,如2的3次方与2的11次方同在,就有可能是野毒感染了。若出现2的11次方或以上时,说明鸡群已发生新城疫强毒的感染。

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